如何鉴定CircRNA的环化来自内含子配对驱动
CircRNA（circular RNA,环状RNA）是一类通常有一个以上外显子构成的环形RNA分子，是非编码RNA研究领域的一个新的研究热点，越来越多的研究人员投入到circRNA的研究。
大部分circRNA研究还处于起步阶段，因此需要系统的研究circRNA的形成、表达与功能。但是目前circRNA的研究，多集中于circRNA的鉴定以及circRNA的ceRNA功能，circRNA的生源机制并没有被足够重视。
基于此种现象，参考《细胞》“Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization”，我们将为大家提供一套可行的circRNA生源机制研究策略。
目前报道的circRNA生源机制主要分为4类（图1）：
(1)套索驱动环化；
(2)内含子配对驱动的环化；
(3)Circular intronic RNAs；
(4)RBP或反式因子驱动环化。
图1 circRNA生源机制
在4种circRNA生源机制中，内含子配对驱动的环化是一种重要的环化机制。已有研究表明，此种机制下，外显子环化主要依赖外显子侧翼的长内含子序列，而侧翼内含子序列包含的反向序列（如ALU序列）在内含子环化时起到重要作用。
参考《细胞》文章，我们认为可通过以下步骤来分析circRNA的形成是否来自内含子配对驱动的环化：
1、circRNA鉴定（包含在染色体中的定位信息）
2、circRNA侧翼intron序列提取
3、circRNA上下游intron反向互补序列分析
4、载体构建实验
这篇《细胞》文章都说了什么？
文章表明，可以环化形成circRNA的人外显子上下游侧翼序列，平均有3个ALU元件，同时这些ALU元件可以形成收敛和扩散IRAlus (inverted repeated Alus, 反向重复Alu元件)，同时他们距离相邻外显子有相同的距离（图2）。而与之相反，选择未环化外显子侧翼内含子对（包含相同数量ALU元件）分析，发现形成的收敛、扩散IRAlus分布无相关性，因此推断IRAlus可介导外显子环化。
图2
而实验验证支持此项推断（IRAlus可介导外显子环化）。人类POLR2A基因某一区段可以转录circular RNA，转录出circular RNA的区段包含两个外显子，其上游内含子包含一段反向ALU序列，下游内含子包含两段正想ALU序列，形成的两种circular RNA具有相同自由能（图3 A）。克隆此区段序列后敲除不同ALU序列，然后构建载体后表达，利用NB和RT-PCR可以看到是否转录circular RNA（图3 B，#2、#5、#6、#7表明敲除后检测不到circularRNA，#3、#4表明敲除后可以检测到circular RNA）。
图3
除了完整ALU序列外，当只存在部分ALU序列时，依然可以检测出POLR2A circular RNA（图4，#2、#3）；而当此区段ALU序列被来自NICN1基因3’UTR的ALU替换后，也可以检测到circular RNA（图4，#4）。
如果将基因POLR2A其他内含子中包含的非重复、互补序列插入POLR2A circular RNA去侧翼内含中，依然可以检测到circularRNA（图4，#5），但破坏此结构，几乎检测不到circular RNA（图4，#6）表明任何互补序列都可以介导circular RNA形成。
图4
IRAlus可介导外显子环化，但是存在IRAlus并不一定介导外显子环化（图5A）。图5展示人类基因ZWILCH 外显子上下游侧翼内含子上包含不同数量、不同AluJr元件，可以各形成3种类型IRAluswithin和3种类型IRAluacross，而小鼠基因ZWILCH则包含不同数量的B1和B2元件（SINE家族），可以形成3种类型IRAluswithin和6种类型IRAluacross（图5B）。跨外显子互补序列配对可以介导circularRNA形成（图5C 左），而相邻外显子间补序列配对只会产生正常线性RNA（图5C 右）。实验证明不同类型的互补序列配对类型彼此间存在竞争关系，影响circular RNA形成（图5D）。
图5
参考文章
Zhang XO, et al. (2014) Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization. Cell. 159(1): 134–147.
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刘元瑞（技术部）丨文案
杨慧丨编辑